ANALISA KARBOHIDRAT (GLUKOSA) METODE LUFF SCHOORL

Karbohidrat adalah senyawa organik terdiri dari unsur karbon, hidrogen dan oksigen memiliki rumus umum (CnCH₂O)₄.   Karbohidrat dengan kata lain merupakan senyawa yang mengandung gugus hidroksi. Ditinjau dari gugus fungsi karbohidrat yang diikat oleh  Aldosa dan Ketosa. Aldosa, karbohidrat yang mengikat gugus aldehid. Contohnya glukosa, galaktosa, ribose.  Sedangkan  Ketosa, karbohidrat yang mengikat gugus keton. Contohnya fluktosa.

Karbohidrat merupakan senyawa karbon, hydrogen dan oksigen yang terdapat dalam alam. Banyak karbohidrat mempunyai rumus empiris CH₂O; misalnya rumus molekul glukosa ialah C₆H₁₂O₆. Senyawa ini pernah disangka “hidrat dari karbonn” sehingga disebut karbohidrat. Dalam tahun 1880-an disadari bahwa gagasan hidrat dari karbon merupakan gagasan yang salahdan karbohidrat sebenarnya adalah polihidroksi aldehid dan keton atau turunan mereka. Karbohidrat sangat beranekaragam sifatnya. Misalnya, sukrosa (gula pasir) dan kapas, keduanya adalah karbohidrat. Salah satu perbedaan utama antara pelbagai tipe karbohidrat ialah ukuran molekulnya. ( Ralp J Fessenden. 1986 : 318)

Ditinjau dari hasil hidroksinya antara lain Monosakarida, Disakarida, Oligosakarida dan Polisakarida.   Monosakarida, karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis menjadi molekul-molekul karbohidrat yang lebih sederhana lagi

Misalnya glukosa, fruktosa, ribose, galaktosa.  Disakarida, karbohidrat yang terbentuk dari kondensasi 2 molekul monosakarida misalnya sukrosa, laktosa, dan maltose.   Oligasakarida, karbohidrat yang jika dihidrolisis terurai menghasilkan 3-10 monosakarida. Misalnya dekstin dan moltosentosa.   Polisakarida, karbohidrat yang terbentuk dari banyak molekul monosakarida. Misalnya pati (amylum), selulosa, dan glikogen.

Beberapa monosakarida penting sebagai berikut :  glukosa dan fruktosa.

Glukosa

            Glukosa dapat diperoleh dari hidrolisis sukrosa (gula tebu) atau pati (amylum). Didalam glukosa terdapat buah-buahan dan madu lebah. Dalam alam glukosa dihasilkan dari reaksi antara karbondioksida dan air dengan bantuan sinar matahari dan klorotil dalam daun serta mempunyai sifat :

·      Memutar bidang polarisasi cahaya kekanan (+52,70)

·      Dapat mereduksi larutan fehling dan membuat larutan merah bata.

·      Dapat difermentasikan menghasilkan alkohol (etanol) dengan reaksi

C₆H₁₂D₆ → 2C₂H₅OH + 2CO₂ 

Fruktosa

            Fruktosa adalah suatu ketoheksasa yang mempunyai sifat memutar cahaya terpolarisasi kekiri dan karenanya disebut juga levulosa. Truktosa mempunyai rasa lebih manis dari pada gula tebu atau sukrosa. Fruktosa dapat dibedakan dari glukosa dengan pereksi Seliwanot, yaitu larutan (1,3 dihidroksibenzena) dalam HCL. Disebut juga gula buah diperoleh dari hidrolisis sukrosa dan mempunyai sifat :

·      Memutar bidang polarisasi kekiri (-92.40)

·      Dapat mereduksi larutan fehling dan membentuk endapan merah bata.

·      Dapat difermentasi.

                        Contoh disakarida yang penting yaitu laktosa. Laktosa memiliki gugus karbonil yang berpotensi bebas pada residu glukosa. Laktosa adalah disakarida pereduksi selama proses pencernaan, laktosa mengalami proses hidrolisis enzimatik oleh laktosa dari sel-sel mukosa usus.

                        Beberapa sifat laktosa :

·      Hidrolisis laktosa menghasilkan molekul glukosa dan galaktosa

·      Hanya terdapat pada binatang mamalia dan manusia.

·      Dapat diperoleh dari hasil samping pembuatan keju

·      Bereaksi positif terdapat pereaksi fehling, benedict, tolluens.

                        Contoh  polisakarida yang paling penting yaitu pati atau amylum. Pati atau amylum merupakan senyawa polimer dari glukosa. Apabila dilarutkan dalam air panas, pati dapat dipisahkan menjadi amilosa dan amipektin. Amipektin ini merupakan polimer yang lebih besar dari amilosa. Amilosa jika dihidrolisis parsial akan menghasilkan amilosa sedangkan jika dihidrolisis lengkap akan menghasilkan glukosa. (Amika. 2012)

Karbohidrat merupakan sumber kalori utama bagi hamper seluruh penduduk di dunia, khususnya bagi penduduk Negara yang berkembang. Pada tanaman, karbohidrat dibentuk dari reaksi CO₂ dan H₂O dengan bantuan sinar matahari melalui proses fotosintesis dalam sel tanaman yang berklorofil.

Sinar Matahari

CO₂ + H₂O                      (C₆H₁₂O₆)n + O₂ (Karbohidrat)

Karbohidrat banyak terdapat dalam bahan nabati, baik berupa gula sederhana, heksosa, pentosa, maupun karbohidrat dengan berat molekul yang tinggi seperti pati, pectin, selulosa, dan lignin. Karbohidrat yang terdapat dalam hasil ternak terutama terdiri dari glikogen.

Pada umumnya karbohidrat dapat dikelompokan menjadi monosakarida, oligosakarida, serta polisakarida.

Monosakarida

Monosakarida mengandung satu gugus aldehida disebut aldosa, sedangkan ketosa mempunyai satu gugus keton. Monosakarida dengan enam atom C disebut heksosa, misalnya glukosa (dekstrosa atau gula anggur).

Oligosakarida

Oligosakarida adalah polimer derajat polimerisasi 2 sampai 10 dan biasanya bersifat larut dalam air. Oligosakarida yang terdiri dari 2 molekul disebut disakarida, dan bila terdiri dari 3 molekul disebut triosa. Bila sukrosa (sakarosa atau gula tebu). Terdiri dari molekul glukosa dan fruktosa, laktosa terdiri dari molekul glukosa dan galaktosa.

Polisakarida

Polisakarida merupakan polimer molekul-molekul monosakarida yang dapat berantai lurus atau bercabang dan dapat dihidrolisis dengan enzim-enzim yang spesifik kerjanya.

Kerusakan pada karbohidrat :

Pencoklatan (Browning)

Pencoklatan enzimatis terjadi pada buah-buahan yang banyak mengandung substrat senyawa fenolik, reaksi pencoklatan non enzimatis belum diketahui atau dimengerti penuh. Umumnya ada 3 macam reaksi pencoklatan non enzimatik yaitu : karamelisasi, reaksi maillard dan pencoklatan akibat vitamin C.

Karamelisasi

Bila gula yang telah mencair tersebut dipanaskan terus hingga suhunya melalui titik leburnya, misalnya pada suhu 170^oC maka mulailah terjadi karamelisasi sukrosa.

Reaksi Maillard

Reaksi-reaksi antara karbohidrat, khususnya gula pereduksi dengan gugus amina primer, disebut reaksi-reaksi maillard. Hasil reaksi tersebut menghasilkan bahan berwarna coklat, yang sering dikendaki atau kadang-kadang malah menjadi pertanda penurunan mutu.

Banyak cara yang dilakukan atau dapat dipergunakan untuk menentukan banyaknya karbohidrat dalam suatu bahan yaitu antara lain dengan cara kimiawi, cara fisik, cara enzimatik, atau biokimia dan cara kromatografi. (Bertha Julisti. 2012)

Karbohidrat adalah golongan senyawa - senyawa yang terdiri dari unsur - unsur karbon (C), hidrogen (H), dan oksigen (O). Senyawa - senyawa ini dapat didefinisikan sebagai senyawa - senyawa polihidroksialdehid atau polihidroksiketon. Di tinjau dari segi gizi, karbohidrat merupakan segolongan senyawa - senyawa penting karena merupakan sumber energi yang paling ekonomis dan paling tersebar luas. Bahan pangan yang dihasilkan di dunia sebagian besar terdiri dari bahan pangan yang kayaakan karbohidrat. Metode luff schoorl adalah berdasarkan proses reduksi dari larutan luff schoorloleh gula - gula pereduksi (semua monoksida, laktosa dan maltosa). Hidrolisis karbohidratmenjadi monosakarida yang dapat mereduksi Cu²⁺ menjadi Cu^1+. Sukrosa tidak memiliki sifat - sifat mereduksi, karena itu untuk menentukankadar sukrosa harus dilakukan inversi terlebih dahulu menjadi glukosa dan fruktosa. Dalam hal ini kadar sukrosa harus diperhitungkan dengan faktor 0,95 karena pada hidrolisis berubah menjadi gula inver.

Karbohidrat terdiri dari bermacam - macam dan menuntut ukuran molekul dapatdibagi dalam tiga golongan, yaitu Monosakarida yaitu karbohidrat yang paling sederhana susunan molekulnya dantidak dapat diuraikan lagi. Yang termasuk dalam golongan ini antara lain glukosa danfruktosa. Disakarida yaitu karbohidrat yang terdiri dari 2 molekul monosakarida. Yang termasukdalam golongan ini antara lain sukrosa, maltosa, dan laktosa. Polisakarida yaitu karbohidrat yang terdiri dari banyak molekul monosakarida. Yangtermasuk dalam golongan ini antara lain adalah pati, glikogen dan selulosa.Metode Luff Schoorl mempunyai kelemahan yang terutama disebabkan olehkomposisi yang konstan. Hal ini diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskanbahwa hasil pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen yang berbeda.(Ahmad. 2010 )

Pada metode Luff Schoorl terdapat dua cara pengukuran yaitu  penentuan Cu tereduksi dengan I₂ dan menggunakan prosedur Lae-Eynon.

Metode Luff Schoorl mempunyai kelemahan yang terutama disebabkan oleh komposisi yang konstan. Hal ini diketahui dari penelitian A.M Maiden yang menjelaskan bahwa hasil pengukuran yang diperoleh dibedakan oleh pebuatan reagen yang berbeda.

Pengukuran karbohidrat yang merupakan gula pereduksi dengan metode Luff Schoorl ini didasarkan pada reaksi sebagai berikut  :

R-CHO + 2 Cu²⁺ R-COOH + Cu₂O

2 Cu²⁺ + 4 I^-        Cu₂I₂ + I₂

2 S₂O₃^2- + I₂       S₄O₆^2- + 2 I^-

Monosakarida akan mereduksikan CuO dalam larutan Luff menjadi Cu₂O. Kelebihan CuO akan direduksikan dengan KI berlebih, sehingga dilepaskan I₂. I₂ yang dibebaskan tersebut dititrasi dengan larutan Na₂S₂O₃. Pada dasarnya prinsip metode analisa yang digunakan adalah Iodometri karena kita akan menganalisa I₂ yang bebas untuk dijadikan dasar penetapan kadar. Dimana proses iodometri adalah proses titrasi terhadap iodium (I₂) bebas dalam larutan. Apabila terdapat zat oksidator kuat (misal H₂SO₄) dalam larutannya yang bersifat netral atau sedikit asam penambahan ion iodida berlebih akan membuat zat oksidator tersebut tereduksi dan membebaskan I₂ yang setara jumlahnya dengan dengan banyaknya oksidator. I₂ bebas ini selanjutnya akan dititrasi dengan larutan standar Na₂S₂O₃ sehinga I₂ akan membentuk kompleks iod-amilum yang tidak larut dalam air. Oleh karena itu, jika dalam suatu titrasi membutuhkan indikator amilum, maka penambahan amilum sebelum titik ekivalen.

Metode Luff Schoorl ini baik digunakan untuk menentukan kadar karbohidrat yang berukuran sedang. Dalam penelitian M.Verhaart dinyatakan bahwa metode Luff Schoorl merupakan metode tebaik untuk mengukur kadar karbohidrat dengan tingkat kesalahan sebesar 10%. (Ratih. 2009)

PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA LOWRY

Protein merupakan suatu polipeprida yang memiliki struktur primer, sekunder, tersier dan kuartener.  Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin digunakana dalam kerja biokimia.  Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi protein, yaitu metode Biuret Lowry, dan lain sebagainya.  Masing-masing metoda mempunyai kekurangan dan kelebihan.  Pemilihan metoda yang terbaik dan tepat untuk suatu pengukuran bergantung pada beberapa faktor seperti misalnya: banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran, alat spektrofotometri yang tersedia (VIS atau UV).  Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang kemudian dikenal dengan metpde Lowry.  Dalam bentuk yang paling sederhana reagen folin ciocalteu dapat mendeteksi residu tirosin (dalam protein) karena kandungn fenolik dalam residu tersebut mampu mereduksi fosfotungsat dan fosfomolibdat, yang merupakan konstituen utama reagen folin ciocalteu, menjadi tungsten dan molybdenum yang berwarna biru.  Hasil reduksi ini menunjukkan puncak absorpsi yang lebar pada daerah merah dari spectrum sinar tampak (600-8000 nm).

            Sensitifitas dari metode folin ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu (metode Biuret).  Kompleks Cu-protein yang dihasilkan oleh reagen biuret akan menyebabkan reduksi pula pada fosfotungstat dan fosfomolibdat dalam reagen folin ciocalteu.  Kira-kira 75% dari reduksi yang terjadi di akibatkan oleh adanya kompleks Cu-protein tersebut, sementara residu-residu tirosin dan triptofan mereduksi 25% sisanya.  Reagen folin ciocalteu merupakan suatu komposisi kompleks yang diperoleh dengan cara pemanasan refluks dari Na-tungstat dan Na-molibdat dengan asam ortho fosfat.  Selain itu disertakan pula komponen-komponen lain untuk meningkatkan kestabilan reagenyang dalam kondisis normal berwarna kuning pucat.

            Pada saat menentukan konsentrasi protein dalam suatu sampel, harus dilakukan pula pengukuran terhadap beberapa larutan protein standar yang memiliki rentang konsentrasi tertentu dimana konsentrasi sampel protein berada di dalam rentang tersebut.  Protein ditambahkan pertama kali ke dalam tabug reaksi kemudian air.  Seluruh tabug harus mempunyai volume akhir yang sama dan dilakukan pengadukan/pencampuran yang baik setiap setelah penambahan zat/reagen.  Reagen penghasil warna selalu ditambahkan terakhir dan biasanya diperlukan selang wakatu tertentu untuk terjadinya reaksi yang sempurna. (Hermansyah,dkk.2012)

Penentuan Angka Penyabunan, Netralisasi Ekivalen dan Gliserol dalam Minyak.

Lipid adalah senyawa organik berminyak atau berlemak yang tidak larut dalam air, dapat diekstrak dari sel dan jaringan oleh pelarut nonpolar, seperti kloroform dan eter.  Asam lemak adalah komponen unit pembangun pada hamper semua lipid.  Asam lemak adalah asam organic berantai panjang yang mempunyai atom karbon dari 4 sampai 24.  Asam lemak memiliki gugus karboksil tunggal dan ekor hidrokarbon nonpolar yang panjang.  Hal ini membuat kebanyakan lipid bersifat tidak larut dalam air dan tampak berminyak atau berlemak (Lehninger, 1982).

            Lipid secara umum dapat dibagi kedalam dua kelas besar, yaitu lipid sederhana dan lipid kompleks.  Yang termasuk lipid sederhana antara lain adalah: 1) trigliserida dari lemak atau minyak seperti ester asam lemak dan gliserol, contohnya adalah lemak babi, minyak jagung, minyak biji kapas, dan butter, 2) lilin yang merupakan ester asam lemak dari rantai panjang alkohol, contohnya adalah beeswax, spermaceti, dan carnauba wax, dan 3) sterol yang didapat dari hidrogenasi parsial atau menyeluruh fenantrena, contohnya adalah kolesterol dan ergosterol (Scy Tech Encyclopedia, 2008).

            Lipid yang paling sederhana dan paling banyak mengandung asam lemak sebagai unit penyusunnya adalah triasilgliserol, juga sering disebut lemak, lemak netral, atau trigliserida. komponen utama dari lemak penyimpan atau depot lemak

pada sel tumbuhan dan hewan, tetapi umumnya tidak dijumpai pada membran.  Triasilgliserol adalah molekul hidrofobik nonpolar, karena molekul ini tidak mengandung muatan listrik atau gugus fungsional dengan polaritas tinggi (Lehninger, 1982).

            Triasilgliserol terakumulasi di dalam beberapa area, seperti jaringan adiposa, dalam tubuh manusia dan biji tanaman, dan triasilgliserolini mewakili bentuk penyimpanan energi.  Lipid yang lebih kompleks berada dekat dan berhubungan dengan protein dalam membrane sel dan partikel subselular. Jaringan yang lebih aktif mengandung lipid kompleks yang lebih banyak, contohnya adalah dalam otak, ginjal, paru-paru, dan darah yang mengandung konsentrasi fosfatida dalam jumlah tinggi pada mamalia (Scy Tech Encyclopedia, 2008).

            Lemak dan minyak atau secara kimiawi adalah trigliserida merupakan bagian terbesar dari kelompok lipida.  Trigliserida ini merupakan senyawa hasil kondensasi satu molekul gliserol dengan tiga molekul asam lemak.

         Secara umum lemak diartikan sebagai trigliserida yang dalam kondisi suhu ruang berada dalam keadaan padat.  Sedangkan minyak adalah trigliserida yang dalam suhu ruang berbentuk cair.  Secara lebih pasti tidak ada batasan yang jelas untuk membedakan minyak dan lemak.

Reaksi dan sifat kimia pada minyak atau lemak:

1.             Esterifikasi

                   Proses Esterifikasi bertujuan untuk asam-asam lemak bebas dari trigliserida, menjadi bentuk ester.  Reaksi esterifikasi dapat dilakukan melalui reaksi kimia yang disebut interifikasi atau penukaran estar yang didasarkan pada prinsip trans-esterifikasi Fiedel-Craft.

2.             Hidrolisa

                   Dalam reaksi hidrolisa, lemak dan minyak akan diubah menjadi asam-asam lemak bebas dan gliserol, proses ini dibantu adanya asam, alkali, uap air, panas, dan eznim lipolitik seperti lipase.  Reaksi hidrolisis mengakibatkan kerusakan lemak dan minyak yaitu “hydrolytic rancidity” yaitu terjadi flavor dan rasa tengik pada lemak atau minyak.  Hal ini terjadi karena terdapat sejumlah air dalam lemak dan minyak tersebut.

3.             Penyabunan

Reaksi ini dilakukan dengan penambahan sejumlah larutan basa kepada trigliserida. Bila penyabunan telah lengkap, lapisan air yang meng-

andung gliserol dipisahkan dan kemudian gliserol dipulihkan dengan penyulingan.

4.             Enzimatis

     Enzim yang dapat menguraikan lemak atau minyak dan akan menyebabkan minyak tersebut menjadi tengik, ketengikan itu disebut “Enzimatic rancidity” Lipase yang bekerja memecah lemak menjadi gliserol dan asam lemak serta menyebabkan minyak berwarna gelap.  Enzim peroksida membantu proses oksidasi minyak sehingga menghasilkan keton.

5.             Oksidasi

Oksidasi dapat berlangsung bila terjadi kontak antara sejumlah oksigen dengan lemak atau minyak.  Terjadinya reaksi oksidasi ini akan mengakibatkan bau tengik kepada minyak atau lemak “Oxidative rancidity”.

6.             Hidrogenasi

Proses Hidrogenasi bertujuan untuk menjernihkan ikatan dari rantai dari karbon asam lemak pada lemak atau minyak.  Setelah proses Hidrogenasi selesai, minyak didinginkan dan katalisator dipisahkan dengan penyaringan.  Hasilnya adalah minyak yang bersifat plastis atau keras, tergantung pada derajat kejenuhan (Anonim, 2011).

           Analisis lemak dan minyak yang umum dilakukan ,dapat digolongkan dalam tiga kelompok tujuan berikut: 1) Penentuan kuantitatif atau penentuan kadar lemak yang terdapat dalam bahan makanan atau pertanian, 2) Penentuan kualitas minyak (murni) sebagai bahan makanan yang berkaitan dengan proses ekstraksinya, atau ada tidaknya perlakuan pemurnian lanjutan misalnya penjernihan, penghilangan bau, penghilangan warna dan sebagainya, 3) Penentuan sifat fisis maupun kimiawi yang khas atau mencirikan sifat minyak tertentu (Riza Julianty, 2008).

         Jenis Minyak dan lemak dapat dibedakan satu sama lain berdasarkan sifat-sifatnya.  Pengujian sifat-sifat minyak tersebut salah satunya adalah penentuan angka penyabunan dan penentuan angka asam.

         Angka penyabunan dapat diartikan sebagai banyaknya (mg) KOH yang dibutuhkan untuk menyabunkan satu gram asam lemak atau minyak. Minyak yang disusun oleh asam lemak berantai C pendek berarti mempunyai berat molekul relatif kecil akan mempunyai angka penyabunan yang besar dan sebaliknya minyak dengan berat molekul besar mempunyai angka penyabunan relatif kecil.

         Angka asam dinyatakan sebagai jumlah miligram KOH atau NaOH yang diperlukan untuk menetralkan asam lemak bebas yang terdapat dalam satu gram minyak atau lemak.

         Angka asam besar menunjukan asam lemak bebas yang besar yang berasal dari hidrolisis minyak atupun karena proses pengolahan yang kurang baik.  Makin tinggi angka asam makin rendah kualitasnya. Sedangkan dengan metode Mojonnier, hasil ekstraksi kemudian diuapkan pelarutnya dan dikeringkan dalam oven sampai diperoleh berat konstan, berat residu dinyatakan sebagai berat lemak atau minyak dalam bahan, Minyak yang disusun oleh asam lemak berantai C pendek berarti mempunyai berat molekul relatif kecil (Andry,2008).

Pada umumnya, alkali yang digunakan dalam pembuatan sabun pada umumnya hanya NaOH dan KOH, namun kadang juga menggunakan NH₄OH. Sabun yang dibuat dengan NaOH lebih lambat larut dalam air dibandingkan dengan sabun yang dibuat dengan KOH.